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Item Isolation, modeling and phytosome forms of antimicrobial and antiproliferative compounds from plectranthus spp.(2016) Matias, Diogo Henrique Correia; Rijo, Patrícia, orient.; Reis, Catarina, dir.; Díaz-Lanza, Ana Maria, dir.Os produtos naturais têm sido uma valiosa fonte de novos produtos farmacêuticos. As plantas de género Plectranthus L'Her (Lamiaceae) possuem uma ampla diversidade de usos etnomedicinais, que correspondem a uma indicação da presença de potenciais fármacos na sua composição. Métodos inovadores para a veiculação dos produtos naturais, como os fitossomas, demostraram ser uma estratégia promissora para a melhora da veiculação e estabilidade destes produtos. Três plantas do género Plectranthus foram estudadas: P. madagascariensis, P. neochilus e P. porcatus. Extratos foram preparados pela conjugação de técnicas de extração como infusão, decocção, maceração, micro-ondas, ultrassons ou de extração por fluidos supercríticos, utilizando como solventes água, acetona, metanol ou dióxido de carbono supercrítico. Os extratos preparados foram perfilados por HPLC-DAD e identificados alguns dos principais componentes, por comparação com padrões, verificando-se na sua constituição polifenois, diterpenos e flavonoides. Os mesmos extratos foram avaliados em termos das suas atividades antimicrobiana (bactérias de Gram positivo, Gram negativo e leveduras), antioxidante (captura de radicais) e citotóxica (células MDA-MB-231). Extratos de P. madagascariensis (maceração e ultrassons em acetona) e P. neochilus (ultrassons em acetona) apresentaram efeitos antibacterianos contra Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis e Klebsiella pneumoniae. O extrato de ultrassons de P. madagascariensis obtido com acetona apresentou potentes efeitos antibacterianos em espécies de Staphylococcus, incluindo uma estirpe resistente à meticilina, verificando-se uma concentração mínima inibitória no intervalo de 1,95 a 7,81 μg/mL. Esta atividade encontra-se de acordo com os usos tradicionais destas plantas como agente anti-infecioso. Os extratos metanolicos apresentaram potentes efeitos antioxidantes a uma concentração de extrato de 100 ng/mL (60,8-89,0%). O extrato de maceração em acetona de P. madagascariensis apresentou alguns efeitos citotóxicos na linha celular de cancro de mama MDA-MB-231 com um IC50 de 64,52 mg/mL. Uma vez que os extratos mais bioativos foram obtidos a partir de P. madagascariensis, estes foram caracterizados em maior detalhe com identificação e quantificação dos principais compostos nesses extratos. Quatro compostos foram identificados por comparação com padrões: ácido rosmarinico, 7α,6β-dihidroxiroyleanona, 7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona e coleona U. Um composto diterpenico foi isolado a partir do extrato de ultrassons com acetona de P. madagascariensis e caracterizado por RMN de 1H e 13C como 7α-formiloxi-6β-hidroxiroileanona. Este composto foi isolado pela primeira vez a partir desta planta. Os efeitos citotóxicos dos compostos purificados foram determinados numa bateria de linhas celulares de cancro e em conjugação com dados da literatura, foram estabelecidas algumas relações de estrutura-atividade na estrutura abietanica do tipo roileanona. Foi observada alguma seletividade para linhas celulares de cancro por parte da 7α,6β-dihidroxiroileanona e 7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona com com índice de seletividade de 4,3 e 3,2 respetivamente.O extrato com maior potência antibacteriana identificado na triagem inicial foi selecionado para sua incorporação numa formulação fitossomal com posterior encapsulação por quitosano. Os fitossomas obtidos apresentavam-se amorfos, uniformes na forma (SEM e AFM), com um tamanho médio de 1082 ± 363 nm e potencial zeta de 20,59 ± 12,02 mV. A eficiência de encapsulação determinada por HPLC (57,7 ± 0,06%). A existência de interações entre os componentes da formulação foi analisada por A ocorrência de encapsulação foi demonstrada por DSC e DRIFTS. Os fitossomas demonstraram uma libertação sustentada com redução da permeação trans-cutanea. Uma melhoria em até 4 vezes na atividade anti-estafilococo (concentração mínima inibitória de 0,49 a 31,25 mg/ml). A segurança desta formulação foi demonstrada por baixa citotoxicidade em queratinocitos humanos in vitro e por irritação negligenciável in vivo nos ensaios de irritação cutânea aguda e sub-crónica em ratinhos. Este estudo demonstrou o potencial do género Plectranthus como fonte de novos agentes antibacterianos justificando-se alguns dos usos etnomedicinais destas plantas. Os diterpenos do tipo abietano isolados a partir de P. madagascariensis possuem efeitos citotóxicos com alguma seletividade face a algumas linhas celulares de cancro. A formulação desenvolvida a partir do extrato de P. madagascariensis corresponde a um promissor candidato a antibacteriano tópico com amplo espectro de atividade e elevada potência.Item Lamiaceae extracts and compounds for topical application through nano delivery systems(2017) Pereira, Filipe Jorge da Silva; Rijo, Patrícia, dir.; Reis, Catarina, dir.; Díaz Lanza, Ana M., dir.La resistencia a los antibióticos es uno de los principales problemas de salud que afectan a todos los continentes, ya sean países desarrollados o en desarrollo. Este tipo de infección es responsable de un elevado número de víctimas, siendo una de las más importantes causas de muerte en todo el mundo, sin una forma efectiva de terapia. Los desarrollos producidos en el campo de la nanotecnología han revelado formas más eficaces de terapéutica, mientras que se desvelan nuevas estructuras procedentes de nuevos recursos naturales nunca antes estudiados. Estas serán las nuevas terapias para este enorme problema. Con este trabajo, se analiza el potencial y la capacidad de la 7α-acetoxi-6β-hidroxiarilanona como un nuevo compuesto para el tratamiento de infecciones asociadas con bacterias resistentes. Del mismo modo, se propone la combinación de una forma terapéutica de origen natural (extracto o compuesto aislado) con una nueva técnica de administración utilizando diferentes tipos de nanopartículas para el tratamiento de infecciones tópicas. La obtención de 7α-acetoxi-6β-hidroxiroiletanona a partir de Plectranthus grandidentatus Gürke se optimizaró, a través de siete métodos diferentes de extracción. La mayor cantidad de 7α-acetoxi-6β-hidroxiroiletanona se obtuvo mediante extracción con fluido supercrítico, suministrando una cantidad de AHR aproximadamente seis veces mayor que la del segundo método mejor evaluado. Se utilizó la 7α-acetoxi-6β-hidroxiarilanona aislada para los estudios de caracterización de sus propiedades fisicoquímicas. Se obtuvieron datos importantes, tales como la estructura molecular y cristalina de la 7α-acetoxi-6β-hidroxiarilanona a partir de la difracción de rayos X de cristal único y se estudió el comportamiento térmico del compuesto mediante calorimetría de barrido diferencial. Se estudió el mecanismo de acción que justifica la alta actividad antibacteriana y la baja citotoxicidad de la 7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona sobre un tipo de cepa de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. Con este objetivo, se realizaron diferentes estudios sobre la interación de este posible nuevo antibiótico en la membrana y en la pared celular de la bacteria. La 7α-acetoxi-6β-hidroxiarilanona ha revelado un efecto no significativo en la permeabilidad pasiva, al mismo tiempo, las bacterias tratadas con esta royleanona muestran disrupción de la pared celular, sin revelar lisis celular. La combinación de nanopartículas con productos naturales se ensayó utilizando dos plantas de la familia Lamiaceae. Para ello se prepararon diferentes extractos de Lavandula stoechas ssp. Luisieri (Rozeira) Rozeira y Lavandula pedunculata (Mill.) Cav. y se estableció su perfil antioxidante por inhibición de la peroxidación lipídica que confirmó dicha actividad. Debido a su alta actividad antioxidante, contenido fenólico y cantidad de flavonoides, los extractos metanólicos de Lavandula stoechas ssp. Luisieri y Lavandula pedunculata fueron seleccionados y encapsulados en nanopartículas de Poli (ácido láctico-co-glicólico). La encapsulación dio como resultado la formación de nanopartículas poligénicas de PLGA con una forma esférica bien definida y un alto rendimiento de encapsulación (˃96%). La permeación epidérmica preliminar de ambos extractos a través de la epidermis humana y su citotoxicidad in vitro en estudios de queratinocitos humanos sugirieron riesgos bajos de toxicidad. También se estudió la combinación de nanopartículas con 7α-acetoxi-6β-hidroxiroileanona. A través de un enfoque diferente, distintas nanopartículas de plata fueron sintetizadas con éxito usando sales de citrato y borohidruro como agentes reductores. La ampicilina, como modelo, y la 7α-acetoxi-6β-hidroxi-roiletanona como nueva forma terapéutica se asociaron con ambos tipos de nanopartículas de plata sintetizadas. La caracterización mostró que se formaron nanopartículas pequeñas y monodispersas con forma esférica. La capacidad antibacteriana del antibiótico cuando se conjugó con nanopartículas de plata fue también elevada. La prueba de irritación cutánea in vivo realizada en modelos animales mostró ausencia de eritema o cambios de color de la piel. En definitiva, el estudio desarrollado sobre esta nueva molécula muestra resultados prometedores para la futura aplicación como antibiótico. El conocimiento de sus propiedades químicas y mecánicas puede dar lugar a estructuras con mejor actividad terapéutica y menores efectos secundarios. Su combinación con la nanotecnología puede conducir a propiedades farmacológicas ventajosas para las personas infectadas con este tipo de bacterias.Item Ligand-functionalized nanoparticles for targeted therapy of melanoma in situ(2016) Silva, Catarina Mendes Alves de Oliveira; Rijo, Patrícia, orient.; Reis, Catarina, dir.; Molpeceres García Del Pozo, Jesús, dir.El melanoma cutáneo es un tipo de cáncer con origen en los melanocitos que se vuelven malignos. El tratamiento del melanoma cutáneo ha evolucionado mucho en los últimos treinta años, sin embargo, no ha conseguido incrementar significativamente la supervivencia de los pacientes con cáncer avanzado. Además, el tratamiento presenta muchas limitaciones, como una reducida especificidad, efectos secundarios graves y multi-resistencia a los fármacos. De hecho, un paso importante para el éxito del tratamiento del melanoma es su detección precoz. En el caso de que no haya metástasis, el cáncer puede ser extirpado por cirugía, pero hay casos en que el riesgo de la intervención, así como el elevado riesgo de recurrencia, obligan a un tratamiento adyuvante. Actualmente, sólo está aprobado un tratamiento adyuvante, con interferón alfa, para estos casos. De este modo, el principal objetivo de esta tesis es el estudio de alternativas para tratamientos adyuvantes, más eficientes y menos agresivos, del melanoma cutáneo. En este contexto, se han estudiado dos estrategias para aplicación de sistemas de nanopartículas. La primera estrategia consiste en el desarrollo de nanopartículas de oro, cubiertas con polímeros naturales y péptidos, con absorción en la región del infrarojo próximo, para terapia fototérmica. La segunda estrategia incluye el desarrollo de nanopartículas hibridas, para encapsulación de compuestos antitumorales, cubiertas con polímeros naturales y péptidos, capaces de una acción química local en el tumor. Conjuntamente, hemos investigado el comportamiento físico-químico y la estabilidad de las nanopartículas para cada aplicación. Reconociendo la importancia de un tratamiento eficaz y específico, ambas las estrategias se basan en un direccionamiento específico hacia las células de melanoma, que sobre-expresan múltiples receptores en su superficie. Por fin, se utilizaron modelos animales de melanoma humano para evaluación de la eficacia de las dos formulaciones propuestas. En conclusión, es posible desarrollar nanosistemas que comprenden diferentes estrategias terapéuticas, basadas en núcleos con estructuras distintas y funcionalización de superficies con múltiples ligandos, para una aplicación amplia y exitosa en los cánceres heterogéneos, tales como el melanoma cutáneo.