Mestrado em Engenharia Biotecnológica
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Item Aspectos da patogenia da piómetra na cadela : fímbrias tipo 1 de escherichia coli e mecanismos de defesa no endométrio(2017) Diniz, Patrícia Ribeiro Leal da Silva; Charmier, Maria Adília Januário, orient.Piómetra é uma doença do foro reprodutivo comum em cadelas sendo Escherichia coli a bactéria mais frequentemente isolada. Neste estudo estabelecemos dois objectivos distintos: a) avaliar a capacidade de E. coli associada a piómetra para transcrever os genes fim e expressar fímbrias tipo 1; b) estudar a resposta imune inata do endométrio, sob a forma de explantes, após estimulação com E. coli. De modo a determinar se os genes fim são transcritos, a orientação (On/Off) do elemento de ADN que contém o promotor e conduz à transcrição dos genes fim, foi determinada por amplificação da região do promotor por PCR, seguida da digestão com a enzima HinfI. Para tal, foram efectuados ensaios em três condições de cultura; agar, arejada, estática. Os resultados mostraram que a maioria dos isolados tem a capacidade de mudar da posição Off para a posição On. Em agar, a posição Off foi predominante (60% dos isolados) e 40% dos isolados apresentaram uma mistura de células na posição On e Off. Na cultura arejada, 80% dos isolados tinham células em posições On e Off e 20% estavam na posição Off. Na cultura estática, a maioria dos isolados (67%) tinha células nas posições On e Off e 7% mudaram completamente para a posição On. Neste estudo demonstrámos ainda que os isolados de E. coli associados a piómetra têm a capacidade de expressar fimbrias tipo 1, uma vez que aglutinam células de levedura. No que se refere ao primeiro objectivo, concluímos que os isolados de E. coli de piómetra têm a capacidade de transcrever genes fim e expressar fimbrias tipo 1. No entanto, a transcrição e expressão estão dependentes de estímulo ambiental. Quanto ao segundo objectivo, mostrámos que os explantes endometriais estimulados com E. coli transcrevem genes que codificam para mediadores de inflamação. Os níveis de transcrição dos genes que codificam para o TNFα, IL-6 e CXCL10 foram significativamente mais elevados em explantes estimulados com E. coli., comparativamente a explantes não estimulados. Por outro lado, a transcrição do gene IL-1β foi menor nos explantes estimulados. Estes resultados demonstram que os explantes de endométrio foram capazes de montar uma resposta imunitária.Item Estudo microbiológico de óleos essenciais e extratos de orégãos e as suas aplicações na saúde(2016) Morgado, Susana Raquel Alves; Charmier, Maria Adília Januário, orient.A Organização Mundial da Saúde encontra-se preocupada com o número de pessoas que são infetadas e que morrem anualmente por contraírem infeções causadas por bactérias multirresistentes. Estima-se que morram mais pessoas infetadas com bactérias resistentes do que em acidentes de viação. Esta situação agrava-se também pela falta de resposta na criação de novos antibióticos. Cada vez mais as bactérias adaptam-se aos antibióticos, por isso a descoberta de novos princípios ativos torna-se lenta dada a rápida adaptabilidade das bactérias. Este trabalho prático foca-se no estudo de atividade antimicrobiana de novos compostos naturais que possam ser alternativas ou em combinação com antibióticos nos tratamentos de infeções causadas por bactérias resistentes. Para este trabalho efetuaram-se os seguintes testes microbiológicos: estudos de suscetibilidade antibacteriana; Kirby – Bauer; suscetibilidade em meio sólido, determinação da concentração mínima inibitória e concentração mínima bactericida, reversões de resistência a determinados antibióticos e determinação de sinergismos pela técnica de checkerboard. Estes testes realizaram-se com dois tipos de bactérias resistentes a antibióticos frequentes em unidades hospitalares, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Para se determinar a atividade antimicrobiana de compostos naturais, utilizam-se 7 tipos de óleos essenciais, nomeadamente, Carvacrol, Cinamaldeído, Tomilho, Óleo do Chá (tea tree oil), óleo de Cravo, óleo de Casca de Canela e Geraniol e também extrato natural de orégão, extraído por duas técnicas diferentes (soxhlet e micro-ondas). Verificou-se que dos 7 óleos testados, o carvacrol apresentou uma grande atividade antimicrobiana. Os mesmos resultados foram obtidos com o extrato natural de orégão. No entanto, observou-se que pela técnica de soxhlet que o extrato do orégão inibe mais o crescimento bacteriano do que pela técnica do micro-ondas. Com este trabalho pode-se concluir que a utilização de compostos naturais poderá ajudar no futuro na inibição do crescimento bacteriano ou mesmo na eliminação de bactérias resistentes a antibióticos.Item Breaking the wall! Deconstruction of the celullosome - a journey from cohesin-dockerinexpression to novel carbohydrate binding module structures(2016) Pires, Ana José de Oliveira Nunes; Sampaio, Pedro, orient.Os Ruminantes estabelecem relações simbióticas, altamente complexas, com bactérias anaeróbias produtoras de celulossomas de forma a degradarem eficientemente os polissacarídeos da parede celular de vegetal. Os celulossomas são compostos por enzimas modulares constituídas por módulos catalíticos ligados a módulos não-catalíticos, envolvidos em ligações proteína:carbohidratos (Carbohydrate-Binding Modules ou CBMs) e interações proteína:proteína (Coesinas:Doquerinas ou Coh-Doc). Este projeto visa ampliar o conhecimento dos celulosomas e dos seus componentes, explorando tanto o complexo Coesina-Doquerina como os CBMs. Apesar de já se encontrar bem caracterizado, o processo de produção e cristalização do complexo Coesina-Doquerina de Bacteroides cellulosolvens, ainda necessita de alguma otimização. Forçando o complexo a adotar apenas uma das suas duas conformações possíveis, através de mutagénese direta, pretende-se testar e otimizar a sua purificação. Os mutantes positivos foram testados em diferentes condições de crescimento, sendo a melhor expressão obtida em células BL21 induzidas a 25ºC em meio LB. Dos vários CBMs ainda por caraterizar de Ruminococcus flavefaciens estirpe FD-1 selecionámos o Rf2 e o Rf4 para, através de géis de afinidade, determinar a sua afinidade a diversos substratos: HEC, β-Glucano, Galactomanano e xiloglucano. Concluímos que a RF2 apresenta maior afinidade para Galactomanano e xiloglucano variando entre 56 e 49 (w/v)-1, respetivamente. A Rf4 apresenta apenas afinidade para o xiloglucano com um Ka significativo de 296 (w/v)-1. Por último, a estrutura deste novo CBM-Rf2 foi resolvida por difração de raios-X por dispersão anómala de comprimento de onda único.Item Valorização de subprodutos da vinha e do vinho-composição fenólica e atividade antioxidante(2016) Oliveira, Vanessa Patricia Felicio de; Bravo, Maria Nubélia Silvestre, orient.O bagaço de uva é um resíduo industrial obtido a partir do processo de fabrico de vinho e grande parte do bagaço produzido pelas vinícolas é desperdiçado. Deste modo, é importante explorar subprodutos de vinícolas, como o bagaço, que apresenta propriedades fitoterápicas de importância para as indústrias farmacêuticas, químicas e de alimentos, permitindo assim agregar valor a este resíduo industrial. O objetivo deste trabalho é determinar a atividade antioxidante usando os métodos DPPH, FRAP e ABTS, além de avaliar o teor em fenóis totais, flavonóides e taninos de subprodutos da vinha e dos vinhos (folha da videira e bagaço de uva),assim como da uva e peles de uva da casta Touriga Nacional. Estas amostras também foram analisadas por espectrometria de massa (MS). Além disso foi também realizada a validação analítica relativamente ao teor em fenóis totais, flavonóides, ABTS e FRAP. Os resultados obtidos permitiram concluir que os métodos analíticos foram validados com sucesso. De uma forma geral o melhor método de extração de fenóis totais e de flavonóides foi o do Soxlet de 6 ciclos (D6c), sendo que a amostra com maior concentração de fenóis totais é o bagaço (BV). A amostra com maior concentração em taninos é a pele de uva (P) e a extração pelo método D6c, permite de uma forma geral obter extratos mais concentrados. O vinho A apresenta um teor superior em fenóis totais e taninos do que o vinho B. Usando o método de DPPH conclui-se que a amostra com maior atividade antioxidante foi o extrato P (método A). A amostra com maior atividade antioxidante ao se aplicar o método FRAP é a P (método D6c), enquanto que pelo método de ABTS é a amostra FV (método D6c). Os resultados demonstram uma boa correlação entre o teor em fenóis totais e flavonóides totais para as amostras P, BV e U. Estabeleceu-se a correlação entre os fenóis totais, flavonóides e a actividade antioxidante. Os resultados preliminares de identificação dos compostos por LC-MS conduziram a duas propostas de identificação de compostos (ácido tartárico e catequina em alguns dos extratos analisados) e na detecção de alguns compostos não identificados, nomeadamente com m/z=133 e m/z=341.Item Valorização da dreche para desenvolvimento de novos produtos(2016) Padinha, Sara Patrícia Pinto; Vasconcelos, Laura da Encarnação Andrade Rainho Teixeira de, orient.Esta dissertação tem como objectivo a valorização da dreche, aproveitando a sua riqueza em termos de nutrientes e evitando o desperdício de um produto que poderá servir como suplemento alimentar no futuro. Como a dreche é um subproduto da produção da cerveja, produzida em grandes quantidades em Portugal e no resto do mundo, conseguimos obter, à partida, um projecto bastante rentável. O objectivo principal é compreender todo o processo de ensilagem e conseguir esquematizar um equipamento para ensilar a dreche, optimizando o pH, a humidade e o oxigénio e aumentando o tempo de vida da dreche de modo a conseguir manipular a matéria-prima com possibilidade de desenvolver novos produtos. Usaram-se dreches da Sagres, à base de malte, e dreches de cerveja artesanal à base de malte e à base de malte e trigo. Foram feitas análises para determinar a quantidade de proteínas, polissacáridos, grupos acetilo e lenhina, tanto das dreches normais como das ensiladas. Acompanhou-se a descida do pH das dreches ensiladas ao longo do tempo, que é um dos indicadores do correcto processo de ensilagem, bem como a perda de massa para cálculo de rendimentos. Foi realizada uma lavagem das dreches ensiladas para quantificação dos ácidos nelas presentes, verificando-se que uma boa ensilagem terá de ter o ácido láctico como ácido maioritário. Foram feitas bolachas com a dreche normal e ensilada proveniente da Sagres e analisadas a nível nutricional. Concluiu-se que o aproveitamento da dreche e a sua conservação são processos que poderão vir a ter relevância e impacto no futuro devido ao elevado potencial em inúmeras aplicações nas mais variadas indústrias.Item Optimização de métodos de manipulação da expressão de genes em células primárias e tecidos(2014) Iria, Inês Raquel da Silva; Videira, Paula, orient.As infecções cirúrgicas são um dos principais problemas a nível hospitalar, contribuindo para o sofrimento dos doentes devido à dor, atraso na cicatrização e consequentemente aumento do tempo de hospitalização. Representam 13% das infecções nosocomiais, dos quais 56,9% são devidas a infecções do local cirúrgico. Esta problemática encontra-se muitas vezes associada a microorganismos com várias resistências antimicrobianas, como a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus (incluindo o S. aureus meticilino-resistente), consequência da utilização de antibióticos de largo espectro. Como tal, pretendeu-se contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de combate a infecções cirúrgicas, através da sobreexpressão de péptidos antimicrobianos, nomeadamente, a utilização de β-defensinas humanas (HBD). Esta sobreexpressão foi efectuada utilizando vectores lentivirais, contendo os respectivos genes, que foram introduzidos no modelo cirúrgico com ratos Wistar. De modo a verificar a capacidade antimicrobiana das HBD seleccionadas, procedeu-se previamente ao estabelecimento e caracterização de culturas das bactérias Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus. Posteriormente estas bactérias foram usadas para infectar o modelo cirúrgico, obtendo-se diferentes graus de infecção consoante a concentração de bactérias utilizadas. Verificou-se em resultados preliminares, uma diminuição da proliferação das bactérias presentes nos modelos cirúrgicos, sempre que se introduziam vectores lentivirais expressando os genes que codificam as HBD. Mais estudos estão a decorrer por forma a confirmar o papel antimicrobiano das HBD no modelo de infecção.Item Desenvolvimento farmacêutico de um medicamento: área analítica(2014) Patrício, Maria Inês Abreu Reis; Bravo, Maria Nubélia Silvestre, orient.A formação académica que adquiri em engenharia biotecnológica permitiu-me alcançar conhecimentos, desenvolver capacidades e competências, em diversas áreas científicas que foram potenciadas com a minha experiência profissional. No presente Relatório Profissional será demonstrada a experiência profissional e formação contínua que obtive na área da indústria farmacêutica ao longo destes nove anos de vida profissional. De forma a demonstrar os conhecimentos, capacidades e competências adquiridas com a função que desempenho integrada numa equipa de Desenvolvimento Farmacêutico, serão abordadas as tarefas que realizo nas várias etapas de desenvolvimento de um novo produto farmacêutico. Vai ser relatado o processo efetuado para o desenvolvimento de um medicamento genérico sob a forma farmacêutica de cápsulas com elevada qualidade, de forma a garantir o seu desempenho ao nível da segurança e eficácia terapêutica. Durante o processo de desenvolvimento farmacêutico do medicamento genérico participei na área analítica, nas seguintes etapas: caracterização físico-química da substância ativa, desenvolvimento galénico, desenvolvimento e validação dos métodos analíticos e estudos de estabilidade. As principais metodologias e ensaios que apliquei no cumprimento das várias etapas do processo de desenvolvimento do medicamento, bem como o tipo de ferramentas que utilizei e os resultados que obtive foram descritos neste relatório.Item Novos genes no diagnóstico genético de Miocardiopatia Hipertrófica(2014) Justiniano, Patrícia Eugénia Nunes; Fernandes, Maria Alexandra Núncio de Carvalho Ramos, orient.A Miocardiopatia Hipertrófica (MH) é uma doença genética cardiovascular, ocorrendo em 1/500 indivíduos da população em geral. É considerada a principal causa de morte súbita em jovens e jovens atletas. A MH apresenta um padrão de transmissão autossómica dominante com elevada variabilidade clínica (mesmo no seio da mesma família) e genética (quer ao nível de locus quer alélica). Esta variabilidade genética influencia a magnitude da hipertrofia cardíaca e o risco de morte súbita. A maioria das mutações descritas estão associadas a genes que codificam para proteínas sarcoméricas. No entanto em mais de 40% dos pacientes com MH não se encontram mutações em genes conhecidos. Vários estudos recentes associam outros genes não sarcoméricos a casos de MH, como por exemplo, genes que codificam para proteínas envolvidas na sinalização de cálcio e nas funções auxiliares ao sarcómero cujas mutações podem ser responsáveis pelo desenvolvimento de MH, quer como genes de susceptibilidade (ACTN2, FHL1, GLA, RAF1, TTR, VCL) quer como genes modificadores (AGTR1). Neste trabalho, pretendeu-se aplicar a técnica de HRM ao diagnóstico genético de MH, analisando um grupo de 58 indivíduos, - 39 indivíduos com diagnóstico de MH sem mutações nos principais genes sarcoméricos previamente identificadas, 9 dos quais são atletas de alta competição e 19 jovens atletas sem diagnóstico de MH. Para tal, foram desenhados, optimizados e testados 14 pares de primers para a aplicação em HRM. Neste trabalho, foi possível detectar as seguintes mutações no gene ACTN2 (IVS7+34G>A, IVS7+80A>G, IVS8+23G>A) e no gene AGTR1, na região 3’UTR 1166A>C, confirmadas por SA. A técnica de HRM diminuiu drasticamente a necessidade de SA, diminuindo os custos e tempo de espera dos resultados.Item Avaliação da capacidade antioxidante de extractos naturais de maçã e azeitona usando modelos celulares em monocamada (2D) e agregados (3D)(2014) Bordalo, Mário Jorge Abrantes Donas-Bôto; Serra, Ana Teresa de Carvalho Negrão, orient.Actualmente, os compostos bioactivos de alimentos têm vindo a ser comercializados na forma de produtos farmacêuticos, cosméticos e aditivos alimentares, reclamando efeito benéfico na saúde. Para o desenvolvimento e comercialização destes produtos é necessário a avaliação das propriedades biológicas. Este trabalho teve como objectivo a avaliação da capacidade antioxidante e neuroprotectora de extractos naturais de maçã e azeitona utilizando ensaios pré-clinicos, nomeadamente métodos químicos e modelos celulares em 2D e 3D. Foram analisados 11 extractos de maçã (variedade Bravo de Esmolfe) obtidos por diferentes tecnologias. A extracção com fluídos pressurizados (EFP) demonstrou ser mais eficiente do que a extracção convencional em termos de rendimento e de compostos extraídos. As condições de EFP 60:40:0 e 90:5:5 (v/v CO2:EtOH:H2O) permitiram obter fracções com maior concentração em compostos antioxidantes e maior capacidade de resgate de radicais livres (EROs) no modelo celular Caco-2, respectivamente. Os principais compostos responsáveis pela actividade antioxidante foram: epicatequina, glucósidos de quercetina e procianidina B2. Para o extracto de bagaço de azeitona, rico em hidroxitirosol, foi demonstrada a capacidade de resgate de EROs e de prevenção da morte celular em agregados de células NT2 diferenciadas em neurónios, sendo que este efeito neuroprotector foi superior ao obtido para o composto puro.Item Estudo de novos marcadores serológicos para o diagnóstico da pneumonia por pneumocystis jirovecii(2012) Calé, Sónia Sofia Dantas; Esteves, Francisco Vaz de Carvalho, orient.Pneumocystis jirovecii (P.j.) é um organismo oportunista responsável por uma das infecções mais severas em doentes imunocomprometidos, a pneumonia por Pneumocystis ou pneumocistose (PPc). O diagnóstico laboratorial é baseado em colorações histoquímicas, imunofluorescência indirecta com anticorpos monoclonais e técnica de PCR em secreções pulmonares. Estudos sugerem que Krebs von den Lungen-6 (KL-6), e S-adenosilmetionina (SAM), poderão ser utilizados como indicadores sensíveis para o diagnóstico da PPc. O objectivo do presente trabalho é a avaliação destes dois marcadores no diagnóstico serológico da PPc, utilizando dois ensaios ELISA. Soro e espécimes pulmonares foram obtidos de 145 doentes (1997-2012). O soro de 37 dadores foi utilizado como controlo negativo. Dos 145 doentes, 92 eram casos confirmados de PPc (mediana: KL-6 969 U/mL; SAM 38 nmol/L) e 53 possuíam outra patologia pulmonar (23 colonizados por P.j. e 30 não infectados por P.j.) (mediana: KL-6 437 U/mL; SAM 60 nmol/L). A mediana determinada para os doentes colonizados foi de 409 U/mL (KL-6) e 55 nmol/L (SAM) e, nos doentes sem infecção com P.j. foi de 440 U/mL (KL-6) e 60 nmol/L (SAM). Nos dadores de sangue, a mediana de KL-6 e SAM foi, respectivamente, de 230 U/mL e 75 nmol/L. Níveis altos de KL-6, no soro, (> 590 U/mL) foram estatisticamente associados aos casos de PPc (76%, P < 0,001). Estes resultados sugerem que o KL-6 poderá ser um candidato para o diagnóstico serológico de PPc, principalmente quando utilizado em associação com outros marcadores.Item Tecnologia de iplex massarray aplicado ao diagnóstico de miocardiopatia hipertrófica(2012) Oliveira, Helena Isabel Farinha de; Fernandes, Maria Alexandra Núncio de Carvalho Ramos, orient.A miocardiopatia hipertrófica (MH) é a doença cardíaca genética mais comum, afectando 1:500 indivíduos, apresentando um padrão de transmissão autossómico dominante, com mutações associadas a genes sarcoméricos e não sarcoméricos. A MH apresenta uma variedade de manifestações clínicas, desde indivíduosassintomáticos a indivíduos que manifestam uma progressão da severidade dos sintomas, podendo nalguns casos ocorrer morte súbita. O diagnóstico clínico é realizado por Electrocardiograma e Ecocardiograma. O diagnóstico genético baseia-se na Sequenciação Automática (SA) dos 5 principais genes sarcoméricos MYBPC3, MYH7, TNNT2, TNNI3 e MYL2, sendo considerada uma metodologia bastante dispendiosa e demorada e que não permite a identificação de mutações em cerca de 1/3 dos individuos. A Genotipagem por iPLEX MassARRAY revela-se uma boa alternativa à SA no diagnóstico genético de MH, uma vez que permite a análise de várias amostras em simultâneo, para um elevado número de mutações, num único ensaio, com uma maior rentabilidade de tempo e recursos. Este trabalho teve como objectivo a optimização e a validação desta metodologia, na detecção de 541 mutações em 33 genes, tendo-se verificado que 29 % das reacções multiplex necessitam de ser revistas, quer pelo desenho de novos conjuntos de primers, quer pela sua relocalização no chip.Item Efeito do tratamento com Tapsigargina nas Isomerases de Dissulfuretos de Melanoma(2012) Veríssimo, Maria Teresa Figueira; Silva, Zélia Maria Cordeiro da, orient.; Fernandes, Maria Alexandra Núncio de Carvalho Ramos, orient.Os fármacos anticancerígenos indutores de stress de reticulo endoplasmático (RE) podem causar a sobreexpressão e/ ou a translocação das isomerases de dissulfuretos (PDIs), classicamente descritas como proteínas residentes do RE, para a superfície celular, com importantes implicações fisiológicas, como, por exemplo, o aumento da resistência à quimioterapia. O objectivo deste trabalho foi investigar o efeito da tapsigargina (TG) na viabilidade celular e na expressão e localização das PDIs e chaperonas de RE nas linhas celulares de melanoma SK-MEL-30 e MNT-1. Verificou-se que as células MNT-1 têm maior susceptibilidade à TG. Também foi demonstrado que a TG induz uma acentuada sobreexpressão de todas as proteínas em ambas as linhas celulares. Inesperadamente, ao nível da expressão fenotípica, verificou-se uma diminuição da expressão de GRP78, em SKMEL-30 e MNT-1, e de CRT, PDI e TMX4 em SK-MEL-30, sugerindo que estas ou não são traduzidas ou são exportadas. Em MNT-1, a expressão fenotípica da CRT aumentou, não havendo alterações para a PDI. Às diferenças de susceptibilidade à TG observadas nas duas linhas poderão corresponder importantes diferenças ao nível da resposta ao stress de RE, que não se esgotam nas diferenças ao nível transcricional, sendo necessários mais estudos para explicar esses fenómenos.