Dupla marcação imunocitoquímica em lâminas previamente coradas : imunofenotipagem de linfoma canino usando apenas uma lâmina citológica
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2024
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Resumo
A imunocitoquímica (ICC) é uma técnica que pode ser usada para imunofenotipagem de linfoma canino. Contudo, a utilidade da ICC é limitada pela quantidade e qualidade do material citológico disponível para a mesma. Os métodos automatizados são mais precisos e tempo eficientes, mas os protocolos tradicionais usam apenas um marcador por lâmina, obrigando ao uso de pelo menos duas lâminas citológicas por caso. A marcação multiplex imunoenzimática permite a localização de dois ou mais antigénios diferentes na mesma amostra com recurso ao uso de diferentes enzimas e cromogéneos para cada marcador. O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o uso de uma técnica de ICC de dupla marcação sequencial numa lâmina citológica previamente corada com May - Grunwald - Giemsa (MGG) para imunofenotipagem de linfoma canino. Para tal, foram retrospetivamente selecionados 31 casos de linfoma canino com diagnóstico de imunofenótipo previamente estabelecido por ICC simples nos seis meses antecedentes, para os quais lâminas de sobra coradas com MGG estavam ainda disponíveis. Para cada caso, foi realizada ICC dupla para Pax5 e CD3 numa plataforma Leica Bond III e as reações desenvolvidas com os cromogéneos Fast Red e DAB para visualização de cada marcador, respetivamente, e as lâminas digitalizadas com um sistema Leica Aperio GT 450. O diagnóstico, percentagem de células positivas e intensidade da coloração foram comparados entre a marcação dupla e a marcação simples. A funcionalidade de "desconvolução de cor" do software QuPath foi usada para facilitar interpretação da coloração. Em 87% dos casos (27/31) foi possível atribuir um imunofenótipo, aumentando para 93% (27/29) se as lâminas de fraca qualidade forem excluídas. Os restantes casos (2/29) foram definitivamente considerados inconclusivos devido a ausência de coloração do marcador Pax5. A percentagem de células positivas foi idêntica entre as duas técnicas para todos os casos, mas a intensidade da coloração ligeiramente menor para o marcador Pax5, sobretudo em casos de linfoma de células T. Os autores concluem que a dupla marcação ICC pode ser realizada em apenas uma lâmina citológica, providenciando excelente concordância com ICC simples em lâminas de boa qualidade. A avaliação simultânea de marcadores de células B e T é um procedimento simples,rápido e fiável que evita a necessidade de recolheita de amostras nos casos em que apenas uma lâmina citológica está disponível. Palavras - Chave: marcação multiplex imunoenzimática, DAB, Fast Red, QuPath, desconvolução de cor
Immunocytochemistry (ICC) can be used for canine lymphoma phenotyping. However, ICC utility is limited by the quantity and quality of cytological material available. Automated methods are more accurate and time efficient, but traditional protocols use one slide per marker, obliging the use of at least two slides per case. Immunoenzimatic multiplex labeling allows the localization of two or more different antigens in the same sample using different enzymes and chromogens for each marker. The present study was conducted with the objective to evaluate the use of an ICC double-staining technique with an automated stainer for lymphoma phenotyping using only one previously-stained cytology slide. Thirty-one canine lymphoma cases immunophenotyped with ICC within the previous 6 months, for which spare previously-stained cytology slides were still available, were retrospectively selected. For each case, double-ICC with CD3 and Pax5 was performed on a Leica Bond III, with DAB and Fast-RED chromogens, and the slides were digitalized using a Leica Aperio GT 450. Diagnosis, percentage and intensity of staining of both ICC techniques were compared. QuPath software color deconvolution functionality was used to ease interpretation of staining. The phenotype was achieved on 87% of the cases (27/31) but increased to 94% if poor quality slides were excluded. Two inconclusive cases were due to absence of Pax5 staining. Percentage of stained cells was similar, but intensity of staining was slightly lower for the Pax5 marker on the double-ICC, mainly in cases of T-cell lymphoma. Automated double-ICC can be performed in just 1 cytology smear, providing excellent agreement with conventional ICC technique in good-quality slides. This simultaneous assessment of B and T-cell markers is a simple and fast procedure that avoids the need for resampling when only one slide is available. Key – words: immunoenzymatic multiplex labeling, DAB, Fast Red, QuPath, color deconvolution
Immunocytochemistry (ICC) can be used for canine lymphoma phenotyping. However, ICC utility is limited by the quantity and quality of cytological material available. Automated methods are more accurate and time efficient, but traditional protocols use one slide per marker, obliging the use of at least two slides per case. Immunoenzimatic multiplex labeling allows the localization of two or more different antigens in the same sample using different enzymes and chromogens for each marker. The present study was conducted with the objective to evaluate the use of an ICC double-staining technique with an automated stainer for lymphoma phenotyping using only one previously-stained cytology slide. Thirty-one canine lymphoma cases immunophenotyped with ICC within the previous 6 months, for which spare previously-stained cytology slides were still available, were retrospectively selected. For each case, double-ICC with CD3 and Pax5 was performed on a Leica Bond III, with DAB and Fast-RED chromogens, and the slides were digitalized using a Leica Aperio GT 450. Diagnosis, percentage and intensity of staining of both ICC techniques were compared. QuPath software color deconvolution functionality was used to ease interpretation of staining. The phenotype was achieved on 87% of the cases (27/31) but increased to 94% if poor quality slides were excluded. Two inconclusive cases were due to absence of Pax5 staining. Percentage of stained cells was similar, but intensity of staining was slightly lower for the Pax5 marker on the double-ICC, mainly in cases of T-cell lymphoma. Automated double-ICC can be performed in just 1 cytology smear, providing excellent agreement with conventional ICC technique in good-quality slides. This simultaneous assessment of B and T-cell markers is a simple and fast procedure that avoids the need for resampling when only one slide is available. Key – words: immunoenzymatic multiplex labeling, DAB, Fast Red, QuPath, color deconvolution
Descrição
Palavras-chave
VETERINARY MEDICINE, LYMPHOMA, CANIDS, IMMUNOHISTOCHEMISTRY, DIAGNOSTIC PROCEDURES, MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA, MEDICINA VETERINÁRIA, VETERINÁRIA, LINFOMA, CANÍDEOS, IMUNO-HISTOQUÍMICA, MEIOS DE DIAGNÓSTICO, Mestrado Integrado em Medicina Veterinária